ГМО И РИСКИ ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ: свойства белков, используемых для генетической трансформации с/х растений
Риски, связанные с производством биотехнологической продукции , начали обсуждаться в научной литературе с 1983 г. К середине 80-х гг. в развитых странах вырабатывается государственная политика по биотехнологии. Так, например, в США контроль за использованием ГМО находится в юрисдикции трех агенств:
- американского Агенства по охране окружающей среды,
- американского Министерства сельского хозяйства,
- американского Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов.
Существует также координационный комитет, осуществляющий согласованную работу всех трех ведомств по данному вопросу. Цели, задачи и законы, регламентирующие деятельность этого комитета, были опубликованы в 1986 году.
Практические оценки влияния ГМО на организм при их пищевом потреблении появились недавно. Первые широкоизвестные работы по пищевым рискам ГМО принадлежат А.Пуштаи, работавшему в Исследовательском институте Рауэтт, Великобритания и стали предметом широко известной дискуссии 1999 – 2000 г.
Однако, возможность формирования выраженного иммунного ответа на трансгенный белок, являющийся аллергеном и потребляемый в составе растительного продукта, были известны и ранее. Например, за три года до начала этой дискуссии Х.С.Мэйсон с соавт. показали высокий иммунный ответ у мышей на трансгенный картофель, модифицированный капсидным вирусным белком. Поскольку работа была посвящена модели оральной иммунизации животных белками, продуцируемыми в трансгенных системах, результаты этой и подобных работ остались незамеченными для диетологов и аллергологов. Тем не менее, работы, посвященные механизмам иммунного ответа человека на лектины, в частности, хлебного дерева и сои, связывающихся с иммуноглобулином и приводящим к слипанию эритроцитов, хорошо известны.
А.Пуштаи показал влияние трансгенного картофеля, модифицированного лектином подснежника, на гистологическом уровне – на состояние слизистой оболочки кишечника, частичную атрофию печени и изменение почек; и на физиологическом – на относительный вес внутренних органов крыс, содержащихся 9 месяцев на соответствующей диете, по сравнению с контрольными, питавшимися нетрансформированным картофелем. На страницах “BINAS NEWS” опубликована полемика 1999 года, как критика и опровержениерезультатов А.Пуштаи, так и позиция сторонников точки зрения А.Пуштаи. Тогда же Е.Дришш и Т.Бег-Хансен публикуют меморандум, поддержавший А.Пуштаи и основанный на экспертной оценке его результатов группой из 20 ученых.
Позднее появляются работы, проведенные на культурах клеток человека и колоректальной карциномы, подтверждающие результаты А.Пуштаи, начинают разрабатываться методики, посвященные оценке пищевых рисков, связанных с действием потенциальных аллергенов. В обзорах по применению ГМО авторы, в том числе и первоначально поддерживавшие А.Пуштаи, указывают на необходимость строгой оценки пищевых и экологических рисков.
Показательна история с сортом кукурузы Старлинк, скандал вокруг которой разгорелся в 2000 – 2001 гг. Эта кукуруза, трансформированная белком-токсином из Bacillus thuringiensis Cry 9C, была разрешена американским Агенством по охране окружающей среды к использованию с ограничениями как кормовая культура в 1998 г. Ограничение в использовании было вызвано результатами тестирования белка белка Cry 9C на устойчивость к перевариванию пепсином и к нагреванию, показавшими устойчивость выше минимально допустимой. В результате неконтролируемого переопыления с пищевыми сортами урожай гибридных растений был использован для получения пищевых продуктов. В ответ фирма «Авентис» предоставила материалы, подтверждающие возможность использования сорта Старлинк в пищевых целях. Данные эксперимента по оценке токсичности и аллергенности модифицированного продукта на 10 крысах, якобы, свидетельствовали о его безопасности. В пользу своей точки зрения «Авентис» указывала на 30-летний опыт применения белка Cry 9C в США в качестве инсектицида, и отсутствие данных в научной литературе по токсичному и аллергенному действию белка Cry 9C. Ряд публикаций, посвященных оценке аллергенности и других возможных воздействий на организм подопытных животных белками Cry 9C и родственному ему Cry 1Ab, показали отсутствие патогенного действия данных белков в составе ГМО. Тем не менее существующие данные по аллергенности токсинов Bacillus thuringiensis побудили провести дополнительные исследования аллергенности Cry-белков. Были получены данные, свидетельствующие о выработке антител и, соответственно, формировании аллергичной реакции на белок Cry1Ac, и ограниченности методов определения иммунных реакций, в частности, теста ELISA, не способного оценивать аллергенность гликозилированных эпитопов белков. Гликозилирование – способность многих аллергенов пищи, и известно, что Cry-белки имеют потенциально гликозилируемые участки и взаимодействуют с мембранными аминопептидазами, что свидетельствует о наличии у Cry-белков гликозил-фосфатидилинозитольного мембранного якоря. Эти данные подтверждают первоначально осторожную оценку в применимости сорта StarLink и оправдывают постоянно ведущийся в США мониторинг сортов кукурузы и производимых из них пищевых продуктов на присутствие белка Cry9С.
Свойства белков, обладающих бактерицидной, фунгицидной и инсектицидной активностью, используемых для трансформации с/х растений
Как правило, токсичным или аллергенным действием обладают трансгенные белки, обеспечивающие устойчивость растений-реципиентов к поражению различными видами насекомых, грибковым и бактериальным заболеваниям. Устойчивость обеспечивается действием белков, обладающих набором специфических свойств. Среди них:
1. ферментативная активность к наиболее мажорным компонентам клеточной стенки целевых организмов (например, хитиназы для насекомых и грибов);
2. лектиновая активность (лектины и арселины), опосредующая связывание с определенными рецепторами и мембранными гликопротеинами и реакцию гликозилирования, приводящую к слипанию клеток желудочно-кишечного тракта и нарушению работы пищеварительных ферментов насекомых-вредителей,
3. ингибирование рибосомальных белков (RIPs-белки), приводящее к нарушению синтеза новых белков клетками, контактирующими с RIPs,
4. ингибирование функций пищеварительных протеаз и амилаз целевых организмов;
5. формирование сквозных каналов в клеточной мембране (Cry-протоксины Bacillus thuringiensis, активизирующиеся после протеолитического расщепления), приводящее к лизису атакованных данными полипептидами клеток;
6. проникновение в виде фрагментов исходного белка через стенки кишечника и связывание с ганглиозидами клеточных мембран (растительные протоксины: уреазы и канатоксины), что приводит к экзоцитозу клеток различных типов, разрушению кровяных пластинок и сопровождается гибелью целевого организма.
Свойства трансгенных белков, обладающих инсектицидной активностью
Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о значительной токсичности или аллергенности представителей большинства указанного класса белков при введении их перорально. Однако, часть из них присутствует и в норме в различных видах употребляемой растительной продукции. Проявление токсичных свойств таких белков будет опосредовано тканевой спецификой их экспрессии и концентрацией самих белков или синтезируемых при их участии продуктов метаболизма, например, ферментов биосинтеза гликоалкалоидов (в частности, соланина) у пасленовых.
Для оценки пищевых рисков при создании устойчивых к вредителям сортов необходимо определить допустимую степень воздействия этих белков на организм, используя традиционные сорта пищевых культур – источников белков этих классов в качестве контроля. Так как число оцениваемых параметров потенциально очень велико, принципиальную роль в таких оценках играет информация о механизмах возможных влияний этих белков на человека и животных.
Уреазы редко используются для трансформации растений, так как для млекопитающих хорошо известен токсичный эффект ряда белков этого класса, выраженный при инъекционном введении белка. Вообще все белки этого класса имеют сходный набор ферментативных и лектиновых функций. Известно, что канатоксины и уреазы не стойки к кислой среде, и поэтому при попадании с пищей в пищеварительный тракт разрушаются еще в желудке. Белки перевариваются в составе растительной ткани, где они содержатся в строго определенных количествах, причем все этапы созревания, транспортировки и запасания белка идут в соответствии с естественными программами регуляции функций клетки. Как ведут себя трансгенные белки с повышенной экспрессией, насколько они доступны действию желудочного сока в составе трансгенной растительной ткани, необходимо выяснять в каждом конкретном случае. Тем более, что значительное увеличение экспрессии уреазы в трансгенных растениях (за счет плейотропных эффектов) показано, например, для коммерциализируемого сорта 30-4-2, устойчивого к пестициду Раундап. Свидетельством важности проверки активности уреаз в трансгенных сортах являются также данные о снижении индекса перевариваемости корма бройлерными цыплятами при повышении активности соевых уреаз в нем, даже несмотря на снижение активности трипсинового ингибитора. Неясно также, как изменяется кругооборот азота в трансгенном растении и каковы последствия этих изменений для разных биоактивных метаболитов, так как механизмы индукции активности уреаз растений пока не выяснены.
Ингибиторы сериновых протеаз обладают множественными функциями. Выполняя у растений роль запасающих белков, белков – регуляторов апоптоза и внутриклеточного протеолиза, они дополнительно способны блокировать ферменты пищеварительного тракта насекомых, действуя как неспецифичные субстраты. Пищеварительные ферменты насекомых, в частности их функциональные домены, сохранили высокое структурное сходство с подобными ферментами позвоночных, в том числе и человека, что приводит к сходному действию на них используемых растительных белков-ингибиторов.
Длительное воздействие на крыс соевыми ингибиторами протеаз в качестве пищевой добавки или муки сырой сои приводило к гипертрофии и гиперплазии поджелудочной железы, вплоть до неопластических новообразований и карциномы. Термальная обработка белков и пищи предотвращает эти эффекты. Подобное действие ингибиторов эндопептидаз сои на поджелудочную железу отмечено и для человека.
Совершенно отсутствуют работы по трансгенным сортам, модифицированным ингибиторами протеаз, с проведенной оценкой рисков, связанных с употреблением сырой и переработанной продукцией. Тем более, что модификация подобными белками овощных культур, употребляемых в сыром виде, несет непосредственную опасность для потребителя. Здесь же следует отметить, что предлагается использовать в качестве трансгенных белков ингибиторы протеиназ млекопитающих, в частности белка-ингибитора бычьего трипсина, обладающего выраженным инсектицидным действием. Однако, эффект длительного воздействия этих белков в составе трансгенной пищи вообще не изучен.
Ряд растительных ингибиторов алфа-амилазы формируют комплексы с ферментами слюнных и поджелудочной желез и достигают максимальной активности при температуре от 35 до 50 градусов С. Некоторые ингибиторы альфа-амилаз хорошо известны как сильные аллергены, например, тетрамерный ингибитор амилазы пшеницы. В работах, посвященных свойствам белков этого класса и их прикладному использованию, перечислено значительное количество токсичных и аллергенных растительных ингибиторов альфа-амилазы и указана необходимость строгих пищевых оценок их пищевых рисков.
Физиологическое действие арселинов на млекопитающих не изучено, но известно, что они близки по структуре и свойствам к фитогемагглютининовым лектинам и ингибиторам альфа-амилазы, что предполагает сходные пищевые риски.
RIPs-белки, или ингибиторы рибосомальных белков, имеют узкую видовую специфичность к различным рибосомальным белкам. Они удаляют консервативный аденин из 28S субъединицы РНК, что препятствует сборке рибосом и приводит к гибели клеток. В силу их высокой специфичности можно подобрать белки, обладающие инсектицидными, фунгицидными или бактерицидными свойствами. Растения, трансформированные такими белками под специфическими вирусными промоторами, устойчивы к вирусным инфекциям, супрессируя выработку вирусных белков в инфицированных клетках. Не стоит забывать, что рицин, один из сильнейших ядов, относится именно к этой группе белков. Другой пример: циннамомин, формирующий устойчивость трансгенных растений к личинкам насекомых, специфичен к 28S РНК крысы. Поскольку инактивация рибосом происходит необратимо, даже слабая афинность RIPs к рибосомальным белкам млекопитающих будет приводить к эффекту накопления. Поэтому проверка безопасности таких белков, выделенных в составе экстракта из трансгенного растения, должна проводиться длительное время, в том числе и на культурах человеческих клеток (что не делается).
Лектины были одними из первых трансгенов при формировании устойчивости к насекомым. Связываясь с гликанами на поверхности клеток, они приводят к слипанию клеток и нарушению физиологических функций организма. С этим свойством растительных лектинов связана 40-летняя история их применения в качестве цитотоксических препаратов при химиотерапии раковых заболеваний.
Высокие пищевые риски при использовании лектинов были подтверждены и в других исследованиях. Так, лектин нарцисса, обладающий ярко выраженными свойствами инсектицида, является мутагеном, причем наиболее сильное мутагенное действие показано на культурах лимфоцитах человеческих эмбрионов и из периферического кровотока детей раннего постнатального периода развития. Эти данные показывают опасность использования данного лектина и близких к нему в первую очередь для наиболее молодой части человеческой популяции.
Проводимые работы с трансгенными инсектицидными лектинами бразильского ореха Bertholletia excelsa были прекращены в связи с их высокой аллергенностью. Хитин-связывающие лектины из проростков пшеницы и фасоли обладают огромным инсектицидным потенциалом, но при этом токсичны для млекопитающих. Поэтому первоначально полученные трансгенные сорта кукурузы с широким спектрам устойчивости к вредителям оказалось невозможным использовать в пищевых целях.
Для трансформации растений ферментами, разрушающими мажорные компоненты клеточной стенки вредителей, обычно хитина, используют растительные хитиназы и хитиназы бактерий и насекомых. Трансгенные конструкции на основе хитиназ сейчас очень популярны: хитиназами сейчас модифицированы различные сорта риса, картофеля, пшеницы и других культур. В то же время хорошо известны так называемые «латексные» или «банановые» аллергии, главным аллергеном в которых выступают хитиназы авокадо, бананов, каштана. Хотя показана высокая аллергенность только хитиназ 1-го класса, возможна модификация трансгенного белка, и близость структур хитиназ разных классов требует тщательной проверки на аллергенность всех трансгенных по хитиназам сортов (что не сделано).
Устойчивость к болезням может также индуцироваться не только белками, но и продуктами обмена веществ – вторичными метаболитами. Сорта кукурузы, табака и томатов с увеличенной экспрессией кислых пероксидаз вырабатывают в листьях повышенное содержание лигнина, препятствующего поражению растений насекомыми-вредителями. Продуктами раздожения лигнина являются токсичные и мутагенные фенолы и метанол. Поэтому увеличение содержания лигнина в силосной массе, плодах и листьях табака представляет прямую опасность. Картофель, устойчивый к ряду болезней, модифицированный пероксидазой и кислой хитиназой, помимо лигнина содержит сублетальное (для растения) количество перекисных радикалов. При этом не изучено, как будут модифицироваться в этих условиях алкалоиды, которыми богаты и пасленовые.
В заключение – об аллергиях. Аллергия на продукты питания – явление достаточно распространенное и неуклонно растущее среди населения развитых стран. Это связано, в первую очередь, с неблагоприятной экологической обстановкой, изменением традиционного рациона питания, к которому каждый народ адаптировался на протяжении многих веков, и современными технологиями пищевой промышленности, приводящими к повышенному содержанию в пище различных ксенобиотиков. И в этом смысле характеристикам трансгенных белков, обладающих инсектицидной активностью, необходимо уделить пристальное внимание, поскольку примерно половина патогенез-зависимых белков растений являются аллеогенами. Повышение их содержания в устойчивых к заболеваниям сортов растений имеет прямой риск повышения аллергенности продуктов питания, изготовленных на основе этих сортов. Детские аллергии – экссудативный диатез и нейродермит – вообще имеют особый статус в аллергологии. Иммунная система человека окончательно формируется только к 12 – 14 годам, а кишечная флора, адаптированная к «взрослой пище» – к 3-м годам. Слизистая оболочка пищеварительного тракта ребенка обладает повышенной проницаемостью как для питательных веществ, так и для патогенов. Это компенсируется высоким содержанием разнообразных иммуноглобулинов и лимфоцитов в крови и слизистой оболочке кишечника ребенка. Детский организм остро реагирует на «чужие» белки, к которым он не адаптирован, отсюда – особенно высокая чувствительность к аллергенам. Исходя из многочисленных наблюдений, фармакологи рекомендовали полностью исключить ГМО из состава детского питания. Начиная с 2004 года, в странах Европейского Союза использование ГМО в продуктах питания, предназначенного для детей до 4-х лет, полностью запрещено.
Пищевые риски, связанные с устойчивостью ГМО к гербицидам
Устойчивость возделываемых сортов к действию пестицидов дает
Большой экономический эффект – ручная или машинная прополка заменяется быстрой и сравнительно дешевой обработкой пестицидами, приводящей к гибели сорняков. Эта практика ведет к увеличению масштабов использования гербицидов и, соответственно, их воздействия на окружающую среду, а также вызывает быстрый отбор видов сорняков, обладающих повышенной устойчивостью к применяемым пестицидам.
Для придания растению повышенной устойчивости к такому распространенному гебициду, как глифосат, используют конструкции на основе одного из двух генов: EPSPS (5-енолпирувилшикимат-3-фосфат-синтаза) и GOX глифосат- оксиредуктаза). Сами по себе эти белки не являются ни аллергенами, ни токсинами.
Для оценки безопасности пищевого применения таких сортов необходимо знать, способность таких сортов к накоплению ядовитых для человека и животных инсектицидов и не происходит ли накопления других ядовитых метаболитов или аллергенов под действием плейотропных эффектов трансгенных конструкций. С иметь ввиду, что практически все пестициды токсичны для человека. Глифосат, например, является канцерогеном, вызывая лимфому. Обычно в работах, посвященных получению устойчивых к гербицидам сортов и их свойствам, указывают на отсутствие негативных свойств, подтвержденных многочисленными проверками. Действительно, исходя из правил получения и дальнейшей валидации трансгенной культуры, оцениваются перевариваемость белков и состав метаболитов нового сорта, учитывается количество встроенных конструкций и нецелевые изменения свойств сорта, отбираются только стабильные трансформанты. Сотрудниками фирмы «Монсанто» было показано, например, хорошее соответствие состава модифицированной сои, устойчивой к глифосату, и родительского традиционного сорта. Но в литературе имеются данные, что при обработке глифосатом устойчивых к нему сортов сахарной свеклы растения накапливают токсичные метаболиты глифосата. Более того, показана способность репродукитвных тканей хлопчатника, устойчивого к глифосату, к очень высокому накоплению этого гербицида от 0,14 до 0,48 мг/г. Это чрезвычайно важно, так как такие дозы при употреблении в пищу будут смертельными (допустимые дозы остаточного глифосата и его токсичных метаболитов в пищевых продуктах в США – 0,02 мг/кг сухого вещества). К сожалению, информация по анализу остаточных концентраций гербицидов в устойчивых сортах в сопровождающих документах и описаниях отсутствует. Насколько широко распространено это свойство устойчивых к глифосату сортов, какова тканевая специфичность накопления глифосата – неизвестно.
Другим эффективным и распространенным гербицидом является атразин. Устойчивость картофеля и табака к его действию обеспечивается встраиванием в геном цитохрома CY1A1, представителя класса Р450 цитохромов. Вместе с тем известно немало работ, посвященных канцерогенным, иммуннотоксичным и эмбриотоксичным свойствам этого вещества. И в этом случае вопрос о накоплении этого гербицида в устойчивых к нему сортах не привлекает внимания разработчиков. А пищевой риск такого накопления огромен.
Модификация метаболизма и плейотропные влияния трансгенных белков
Пищевые риски могут быть связаны с действием плейотропных эффектов как самих трансгенных белков, так и регуляторным действием встроенных конструкций. Несмотря на правила валидации трансгенных сортов, обнаружить нецелевые изменения метаболизма, активности различных белков, включая лектины и фитогормоны, просто – исследователь не знает точно, что проверять. Изменения могут быть не количественными, а качественными, например, состава минорных фракций гликоалкалоидов, которые совместно могут обладать многократным синергетическим усилением мембранолитической активности. Существуют ли объективные основания для таких опасений?
С конца 90-х годов проводилось изучение биосинтеза флавоноидов, природных антиоксидантов, участвующих в защите тканей растения от негативных последствий фотохимических реакций, В настоящий момент существуют трансгенные сорта помидоров и картофеля с усиленной продукцией флавоноидов. Принято считать, что повышенное содержание флавоноидов на организм человека положительно. Но такое изменение метаболизма растений может приводить к росту пищевых рисков. Так, масс-спектрофотометрический анализ трансгенного картофеля показал резкое изменение состава минорных фракций гликоалкалоидов. Для оценки пищевых рисков в таких случаях необходимо проведение долговременных тестов, которые пока не проводятся.
Проводя работы по созданию трансгенных растений с устойчивостью к стрессующим факторам, и для увеличения урожайности используют ключевой фермент синтеза полиаминов – аргинин декарбоксилазу. Результатом гиперэкспрессии этого фермента у трансгенных табака и риса является повышенное содержание агматина – его непосредственного метаболита, и в ряде случаев – рост концентрации вторичных метаболитов путрисцина, спермидина и спермина. При этом как агматин, так и его производные, являются биологически активными веществами, способными взаимодействовать с адренэргическими, имидазолиновыми и глутаматными рецепторами, выступая для организма человека в роли как нейромедиаторов, так и активаторов митоза и способствуя опухолеобразованию. Будучи небелковой природы, эти вещества легко усваиваются организмом. Адекватность используемых в настоящий момент тестов для проверки таких рисков сомнительна.
Не обойдены вниманием производителей и цитокинины – растительные гормоны, производные пурина. Сорта томатов, модифицированные генами изопентилтрансферазы и бактериальной фитоэнсинтазы, обладают повышенной продуктивностью. Однако, сложнейшая регуляторная сеть, включаемая действием цитокининов в организме растения и затрагивающая как метаболизм, так и разнообразные тканевые и ростовые процессы, только изучается и предсказать все эффекты от такого рода изменений пока невозможно. Но показано, что содержание фитогормона зеатина пуринового ряда и его производных растет. Известны сильнейшие эффекты этих гормонов на клетки человека и млекопитающих различных типов за счет модуляции Ras-опосредованных клеточных сигнальных каскадов, ацетилхолинэстеразной активности, активности пуринорецепторов. Пока допустимые безопасные концентрации используемых фитогормонов в растительных продуктах не определены, остается высоковероятным пищевой риск с использованием этих технологий.
У сорта пшеницы, модифицированного кислой глюконазой и хитиназой, наблюдалась гиперэкспрессия специфической фенилаланин-аммоний-лиазы и связанное с этим накопление салициловой кислоты, приводящее к некрозам растительной ткани. Сама салициловая кислота обладает массой полезных свойств и в модифицированном виде хорошо известна как аспирин, вот только в качестве пищевой добавки к хлебу или макаронам она может не подойти.
|
